Molecular Biology and Genetics / Moleküler Biyoloji ve Genetik
Permanent URI for this collectionhttps://hdl.handle.net/11147/9
Browse
4 results
Search Results
Research Project Genomik profilleme yöntemiyle T lenfositlerinde apoptozu düzenleyen mikroRNA' ların tanımlanması(2010) Akgül, Bünyamin; Nalbant Aldanmaz, Ayten; Yiğit, HaticeBiyolojik homeostazın temin edilmesinde temel bir işlevi olan ve evrimsel olarak oldukça muhafaza edilmiş olan hücre ölümü, ihtiyaç fazlası hücreler ile sağlığı tehdit eden antijenlerin vücuttan uzaklaştırılması için oldukça önemlidir. Apoptoz sinyal iletim yolağında rol oynayan ilk molekülün tanımladığı 1992 yılından bu yana bir dizi protein tanımlanmıştır. Ancak apoptoz sadece proteinler tarafından değil, mikroRNA (miRNA) adı verilen ve boyutları 17-25 nükleotit arasında değişen çok küçük kodlamayan RNA’lar tarafından da düzenlenmektedir. Apoptozu düzenleyen miRNA’ların tanımlanması, hücre ölümünün moleküler mekanizmasının anlaşılması ve insan sağlığının korunması için oldukça önemlidir. T lenfositlerinde apoptozu düzenleyen miRNA’ları tanımlamak amacıyla Jurkat hücreleri genel apoptoz indükleyici kamptotesin ilacıyla muamele edilmiştir. Kamptotesim muamelesi sonrası, apoptoza duyarlı ve dirençli hücreler birbirinden ayrıştırılmıştır. Mikroarray, derin sekanslama ve qPCR teknikleri kullanılarak her iki grubun miRNA profilleri kamptotesinle muamele edilmeyen negatif örneklerin miRNA profiliyle karşılaştırılmıştır. Karşılaştırmalı profil analizi sonrası her üç grup hücrede ifade edilen miRNA miktarına göre beş grup miRNA belirlenmiştir. miR-18a, 26a ve 92a-1* ölen hücrelerde baskılanmakta miR-7, 106b*, 221, ve 1268 ise ölmeyen hücrelerde aşırı ifade edilmektedir. Dolayısıyla bu grup miRNA anti-apoptotik olarak görev yapmaktadırlar. miR-128 ve 720, ölmeyen hücrelerde aşırı ifade edilirken ölen hücrelerde baskılanmakta dolayısıyla anti-apoptotik miRNA grubunda bulunmaktadırlar. miR-24 ve 766 sadece dirençli hücrelerde baskılandığından apoptotik miRNA olabilirler. miR-30c, 186, 142-5p ve 320 hem duyarlı hem de dirençli hücrelerde baskılandığından muhtemelen apoptozla ilgileri olmayıp ilaç metabolizması veya stres gibi diğer hücresel yanıtlarda rol oynuyor olabilirler.Research Project İnsanda Apoptozu Düzenleyen Uzun Kodlamayan Rna’ların Belirlenmesi ve Fonksiyonel Karakterizasyonu(2016) Akgül, BünyaminApoptoz birçok hücresel fonksiyonların saglıklı yürütülmesi için oldukça önemlidir. Apoptoz hızındaki azalmalar kanser ve otoimmun hastalıklara, hızlanma ise akut ve kronik dejeneratif hastalıklara ve immun sistemde yetersizliklere yol açmaktadır. Hücresel homeostazın saglanmasında görev yapan apoptozun düzenlenmesinde rol oyanan bir dizi protein ve mikroRNA bilinmesine ragmen, apoptozun düzenlenmesinde rol oyanan protein kodlamayan bu RNA?lar (uzun kodlamayan RNA, ukmRNA) tam bilinmemektedir. Apoptozun düzenlenmesinde rol oynayan ukmRNA?ları belirlemek için bu çalısmada HeLa hücreleri model olarak kullanılmıstır. Intrinsik ve ekstrinsik apoptotik yolagın her biri ikiser ayrı ajan ile aktive edilmistir. Yolakların aktivasyonu sonrası izole edilen RNA?lar derin sekans analizine tabi tutuldugunda, ukmRNA?ların ligand tipine baglı olarak farklı profil sergiledigi gözlemlenmistir. Ifadelerinde farklılık tespit edilen 4 aday ukmRNA?nın susturulması HeLa hücrelerinin apoptoz oranlarında artısa yol açmıstır. Ilginç bir sekilde aday ukmRNA ifadesi ile antisense oldukları kodlayan gen ifadesi arasında ters bir korelasyon belirlenmistir. Aday ukmRNA?ların susturulmasının apoptotik sinyal ileti yolaklarına olan etkilerini belirlemek için bu hücrelerde ikinci bir RNA-seq çalısması yapılmıstır. Bu çalısma, özellikle GTF2A1-AS susturulmasının apoptotik genlerin ifadesinde degisime yolaçtıgını göstermistir. Sonuç olarak, HeLa hücrelerinde apoptozu düzenleyen yeni bir ukmRNA tespit edilmis ve fonksiyonel olarak karakterize edilmistirResearch Project Anti-apoptotik Gtf2a1-as Uzun Kodlamayan Rna’sının Hücreiçi Konumunun ve Etkileştiği Komplekslerin Tanımlanması(2018) Akgül, BünyaminApoptoz gerek normal gelişim esnasında, gerekse patolojik olgularda hücresel dengenin sağlanmasında oldukça önemlidir. Nitekim, apoptozun yavaşlaması veya engellenmesi kanser ve otoimmun hastalıklara yok açar iken, apoptoz oranında meydana gelen hızlanmalar akut ve kronik dejeneratif hastalıklara ve immun sistemde yetersizliklere yol açmaktadır. Bu nedenlerden ötürü, apoptozun düzenlenmesinde çok değişik makromoleküller görev yapmaktadır. Bu düzenlemeden sorumlu proteinlerin varlığı uzun süredir bilinmekte olup son yapılan çalışmalar kodlamayan RNA’ların da bu düzenlemede aktif rol oynadıklarını işaret etmektedir. Daha önce tamamlanan 113Z317 No.lu proje kapsamında yaptığımız transkriptomik bir tarama, GTF2A1 kodlayan genine antisense olan bir RNA transkriptinin (GTF2A1-AS olarak adlandırılmıştır) apoptozun düzenlenmesinde rol oynayabileceğine işaret etmiştir. GTF2A1-AS protein kodlamayan transkriptinin apoptozun düzenlenmesinde oynadığı rolün moleküler mekanizmasını aydınlatmak için yapılan 216Z137 No.lu bu TÜBİTAK projesinde HeLa hücreleri model olarak kullanılmıştır. Bu transkriptin koordinatları tam olarak raporlanmadığı için, öncelikle RACE (rapid amplification of cDNA ends) yaklaşımı kullanılarak transkriptin uç sekansları elde edilmiş ve RNA sekans verileriyle karşılaştırılmıştır. Sisplatin ile miktarında artış belirlediğimiz transkript çekirdekte lokalize olmaktadır. GapmeR ile susturma sonrası miktarı değişen mRNA transkriptleri PANTHER yazılımı ile incelendiğinde apoptotik işlevlerde değişim olduğu gözlenmiştir. İlave biyoinformatik analizler, etkilenen yolakların BCL2-p53 aksı üzerinde olabileceğini işaret etmiştir. Western blot sonuçları da bu verileri doğrulamaktadır. GTF2A1-AS transkriptinin etkileştiği proteinleri belirlemek için yapılan immümçöktürme çalışmalarında, GTF2A1-AS’in HIST2H4A, HNRNP-K ve HNRNPA2B1 proteinleriyle birlikte çöktüğü tespit edilmiştir. Sonuç olarak, HeLa hücrelerinde apoptozu düzenleme potansiyeline sahip GTF2A1-AS kodlamayan transkriptinin tam sekansı elde edilmiş, hücre içi lokalizasyonu ve etkileştiği proteinlerin bir kısmı tanımlanmıştır.Research Project Gen İfadesinin Yeni Düzenleyicileri Halkasal Rna’ların Apoptotik Yolaklara Olan Etkilerinin Araştırılması(2019) Akgül, Bünyamin; Aldanmaz, Ayten Nalbant; Allmer, JensApoptoz gerek normal gelişimde gerekse kanser, otoimmun ve dejeneratif hastalıklar gibi bir dizi patolojik olgularda önemli rol oynayan hücresel bir işlevdir. Apoptotik mekanizmalar üzerine yapılan araştırmalar, apoptotik yolakların protein kodlayan genler yayında protein kodlamayan genler tarafından da düzenlendiğini göstermektedir. Bu bağlamda miRNA’lar ve uzun kodlamayan transkriptler en iyi karakterize edilmiş kodlamayan RNA türlerini oluşturmaktadır. Son iki yılda derin sekanslama protokollerinde ve ilgili derin sekans verilerinin incelenmesinde kullanılan biyoinformatik algoritmalarda yapılan değişiklikler, lineer kodlamayan transkripter yanında halkasal formda kodlamayan transkriptlerin (halkasal RNA) keşfine yol açmıştır. Çekirdek ve sitoplazmada lokalize olabilen ve genomun çok farklı bölgelerinden üretilen halkasal RNA’ların biyogenezi, moleküler fonksiyonu, etkileştikleri diğer moleküller ve regülasyonlarıyla ilgili bilgiler oldukça sınırlıdır. İnsanda intrinsik ve ekstrinsik yolağın düzenlenmesinde rol oynayan halkasal RNA’ların sistematik bir yaklaşımla belirlenmesini amaçlayan bu projede genetik manipülasyonların kolay olduğu HeLa hücreleri model olarak seçilmiştir. Hipotezler ayrıca Jurkat ve MCF-7 hücrelerinde test edilerek tanımlanan RNA’ların hücreye özgün olup olmadığı araştırılmıştır. HeLa hücrelerinde intrsinsik yolak doksorubisin ve sisplatin ile ekstrinsik yolak ise anti-FAS/CD95 antikoru ve TNF-alfa ile tetiklenecek ve izole edilen RNA’lar derin sekans analizine tabi tutulmuştur. Kümeleme çalışmaları, kullanılan liganda göre ifadesi değişen halkasal RNA’lar olduğunu göstermiştir. qPCR ile doğrulanan adaylardan bir tanesi HeLa hücrelerinde susturularak fonksiyonel teste tabi tutulmuştur. Ayrıca biyoinformatik analizler, bazı aday halkasal RNA’ların proteine çevrilme potansiyeli olduğunu gösterirken diğer bazı adayların miRNA süngeri olarak görev yapabileceğine işaret etmektedir.