Eksozom Tayini İçin Plazmonik Temelli Sensör Platformu Geliştirilmesi

Abstract

Eksozom Tayini İçin Plazmonik Temelli Sensör Platformu Geliştirilmesi Amaç: Kanser vakalarında yüksek ölüm oranına rağmen erken teşhis ile vakaların %40?ının tedavisinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Mevcut altın standart olan doku biyopsisine alternatif olarak geçtiğimiz yıllarda likit biyopsi yöntemi önerilmiştir. Bu çalışmada amaç plazmonik temelli bir sensör platformu geliştirilerek likit biyopsi ile kanser biyobelirteci olabilecek eksozom proteinlerinin tayininin sağlanmasıdır. Bu amaçla literatürde küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (KHDAK) biyobelirteci olarak gösterilen CD151 ve EpCAM proteinini yapısında bulunduran in-vitro eksozomların üretimi A549 KHDAK hücre hattı kullanılarak sağlanmış ardından eksozomlar izole edilerek sensör platformunu test etmek için kullanılmıştır. Gereç ve yöntem: Platform üretimi için altın nanoparçacık (AuNP) sentezi yapılıp AuNP?lar mikroplakalara immobilize edilmiştir. İmmobilize AuNP?lar CD151 ve EpCAM antikorları ile ayrı ayrı fonksiyonlandırılmıştır. Sensör platformunun optimizasyonu AuNP sentez süresi, antikor miktarı ve antikor interaksiyonu için inkubasyon süresi çalışılarak yapılmıştır. Sonrasında ilgili protein standartları kullanılarak platformun çalışma aralığı ve tayin limiti belirlenmiştir. Eksozom izolasyonu için ticari kit kullanılmış ve izole eksozomların karakterizasyonu toplam protein tayini, western blot, immunohistokimyasal boyama ve zeta sizer DLS analizleriyle yapılmıştır. Yapılan analizlerin ardından eksozom örnekleri geliştirilen sensör platformunu test etmek için kullanılmıştır. Bulgular: Çalışmanın optimizasyon adımında AuNP üretimi için ideal sürenin 90 dk, immobilizasyon için uygun antikor konsantrasyonunun %2 ve inkubasyon süresinin 60 dk olduğu görülmüştür. EpCAM ve CD151 proteinleri için tayin limitleri sırası ile 2,9 ve 0,9 nM olarak hesaplanmıştır. İzolat içerisindeki eksozom konsantrasyonunun 2,9 x 109 eksozom/ml olduğu, eksozomların yapılarında CD151, EpCAM ve eksozom biyobelirteci olan CD81 proteinlerini taşıdığı, toplam protein miktarının 1,32 mg/ml olduğu gösterilmiştir. Sensör platformu ekozomlar ile test edildiğinde tayin limitleri anti-CD151 ve anti-EpCAM ile hazırlanmış platformlar için sırasıyla 7,62 x 104 ve 3,14 x 104 eksozom/ml olarak hesaplanmıştır. Sonuç: Sonuç olarak bu çalışmada literatürde ilk defa eksozomların tayini için immobilize LSPR-temelli sensör platformu geliştirilmiştir. Geliştirilen sensör platformunun hassasiyet ve kolay kullanıma sahip olması kanser teşhisi çalışmaları için uygun bir aday olduğunu göstermektedir.