Development and Characterization of Affinity-Maturated Nanobodies Targeting B-Lymphocyte Antigen Cd19

Abstract

B-Hücre Akut Lenfoblastik Lösemi (B-ALL), B-lenfositlerin kontrolsüz çoğalması ile karakterize bir lösemi alt tipidir. B-ALL tanısı kan sayımları, immünfenotipleme, sitogenetik analiz ve moleküler testlere dayanır. B-ALL tedavi stratejileri arasında kemoterapi, radyoterapi, allojenik kemik iliği nakli ve kök hücre nakli bulunur. B-ALL'nin tanı ve tedavisinde, bir B-lenfosit antijeni olarak bilinen CD19 proteinine özgü antikorlar veya antikor parçaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, hedef antijenlere özgü antikor üretimi genellikle yüksek maliyetlidir. Yalnızca ağır zincirli deve antikorlarının ağır zincir değişken bölgesini oluşturan nanokütlelerin (nanobody, Nb) daha avantajlı olduğu gösterilmiştir. (H. Wang ve ark., 2021a) çalışmasında, doğal bir Nb-ekspresyonlu faj gösterim kütüphanesinden seçilen ve CD19'a afinitesi olan üç nanokütle (Nb) test edilmiştir. Deve antikorlarının ağır zincirlerinden türetilen ve antikorların tek zincirli ağır değişken bölgesini oluşturan bu nanokütleler in-silico olarak olgunlaştırılmıştır. Üç nanokütleden ikisi, in-silico performanslarına dayanarak dört varyantla birlikte seçilmiştir. Bu çalışmanın amacı, kurum içinde geliştirilen afinite olgunlaştırma protokolünün (yapı tahmini, filtreleme ve derecelendirme) uygulanabilirliğini, afinitesi olgunlaştırılmış varyantların in-vitro üretimi ve fonksiyonel karakterizasyonuyla ana nanokütlelere karşı doğrulamaktır. Ayrıca, nanokütlelerin in-silico afinitesi olgunlaştırılmasıyla ilgili çeşitli paradigmalar ve modellerin deneysel gerçeklik karşısındaki durumu üzerine değerlendirmelerde bulunulmuştur.

B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia (B-ALL) is a subtype of leukemia characterized by the uncontrolled proliferation of B-lymphocytes. The diagnosis of B-ALL relies on blood counts, immunophenotyping, cytogenetic analysis, and molecular tests. Treatment strategies for B-ALL include chemotherapy, radiotherapy, allogeneic bone marrow transplantation, and stem cell transplantation. In the diagnosis and treatment of B-ALL, antibodies or antibody fragments specific to CD19, a protein known as a B-lymphocyte antigen, are commonly used. However, producing antibodies specific to targeted antigens is often cost-prohibitive. Nanobodies, which constitute the heavy chain variable region of heavy-chain only camelid antibodies have been elucidated to be more advantageous. Three nanobodies (Nbs), which were chosen from a natural Nb-expressing phage display library in the study of (H. Wang et al. 2021a), with affinity to CD19 were tested. The nanobodies, which are derived from the heavy-chain antibodies of camelids and constitute the single-domain heavy variable region of the antibodies, were maturated in-silico. Two parent nanobodies, out of three, were chosen alongside four variants based on their in-silico performance. The purpose of this study is to verify the applicability of our in-house affinity maturation protocol (structure prediction, filtering, and scoring), by in-vitro production and functional characterization of affinity maturated variants against their parents nanobodies. Moreover, it is reflected on multiple paradigms concerning in-silico affinity maturation of nanobodies, and how models fare under the reality of experimentation.