Chemical Characterization of Caldanaerobacter Subterraneus Subsp. Tengcongensis Heme-Nitric Oxide/Oxygen Binding Protein

Abstract

Hemoproteins, which contain the heme prosthetic group , take part in different biological processes in many stages of life. Their ability to catalyze important biosynthesis reactions makes them good candidates for understanding and elucidating complex mechanisms for biocatalysis. In this study, the catalytic properties of thermophilic Thermoanaerobacter tencogensis nitric oxide/oxygen binding protein, a heme protein reshaped by rational design, were investigated and chemical characterization was carried out. The peroxidase activity of the enzyme was investigated by the oxidation reactions of guaiacol, amplex red and 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS). Kinetic parameters of the reactions were determined. These obtained results demonstrated that, in the presence of H2O2, wild type and Y140H TtH-NOX proteins are able to catalyze oxidation reactions of guaiacol, Amplex red and ABTS. Comparison of the kinetic parameters showed that Y140H mutant catalyzed the guaiacol and ABTS oxidation 3-fold and 15 -fold faster than wild type enzyme, respectively. The stability of TtH-NOX proteins were investigated in the presence of organic solvents. Results were demonstrated that WT TtH-NOX was more stable than Y140H mutant in the presence of organic solvents In addition to these, for the first time, thermophilic TtH-NOX proteins were immobilized with a novel enzyme immobilization method and organic-inorganic hybrid nanostrucrures were obtained. Copper ion incorporated TtH-NOX-based hybrid nanoflowers were synthesized at different pH values. SEM and EDX analysis of TtH-NOX-based hybrid nanoflowers proved that free TtH-NOXs were immobilized successfully.

Hem prostetik grubuna sahip olan hemoproteinler, yaşamın pek çok aşamasında farklı biyolojik süreçlerde yer alırlar. Önemli biyosentez reaksiyonlarını katalize etme yetenekleri, onları biyokataliz için karmaşık mekanizmaları anlamak ve aydınlatmak için iyi adaylar yapar. Bu çalışmada rasyonel tasarımla yeniden şekillendirilen bir hem proteini olan termofilik Thermoanaerobacter tencogensis nitrik oksit/oksijen bağlayıcı proteininin katalitik özellikleri incelendi ve kimyasal karakterizasyonu yapıldı. Enzimin peroksidaz aktivitesi, gayakol, ampleks kırmızısı ve 2,2'-azino-bis(3-etilbenztiazolin-6-sülfonkasit)(ABTS) in oksidasyon reaksiyonları ile araştırıldı. Reaksiyonların kinetik parametreleri belirlendi. Sonuçlar hidrojen peroksit varlığında doğal ve mutant Y140H TtH-NOK proteinin gayakol, Ampleks kırmızısı ve ABTS oksidasyonlarını kataliz edebildiğini gösterdi. Kinetik parameterlerin karşılaştırılması Y140H mutantının gayakol oksidasyonunu 3 kat ve ABTS reaksiyonunu da 15 kat olmak, üzere doğal TtH-NOK tan daha hızlı gerçekleştirdiğini gösterdi. TtH-NOK proteinlerinin organik solventlerdeki stabilitesi araştırıldı ve sonuçlar doğal TtH-NOK proteinin organik solventlerin varlığında Y140H mutantından daha stabil olduğunu gösterdi. Bu çalışmaların yanısıra, ilk kez termofilik TtH-NOK proteinleri yeni bir enzim immobilizasyon yöntemi ile immobilize edilerek organik-inorganik hibrit nanoyapılar elde edildi. Bakır iyonları ve TtH-NOK proteinleri kullanılarak farklı pH aralıklarında çiçek benzeri şekillere sahip TtH-NOK -inorganik hibrit nano (TtH-NOK-ihN) yapılar sentezlendi. SEM ve EDX analizleri sonucunda başarılı bir şekilde serbest TtH-NOK enzimlerinin immobilize edildiği gözlendi.