Generation of Mutant Libraries for Directed Evolution of a Thermophilic P450 Enzyme

Abstract

Directed evolution, inspires from natural selection, is a frequently utilized approach in protein engineering for designing enzymes. It allows iterative evolution of existing proteins towards the ones with desired characteristics by the application of random mutagenesis in the laboratory. However, library construction constitutes the most fundamental part of directed evolution. Application of different construction methods affects both the number and diversity of variants created and the screening/selection techniques used. Early procedures including error-prone PCR, mutator strains, chemical mutagens and gene shuffling have been successful in whole gene mutagenesis yet have been required more screening/selection effort by leading larger libraries. On the other hand, recent approaches such as use of degenerate primers and site saturation mutagenesis have decreased the screening/selection effort by allowing random mutagenesis of amino acids located at specific positions in the polypeptide chain. Especially, active site residues of biocatalysts were chosen as targets and the catalytic efficiencies were enhanced. CYP119, a member of cytochrome P450 protein family, from Sulfolobus Acidocaldarius is a thermostable enzyme capable of catalyzing peroxidation, monooxygenation and oxidoreduction reactions. Here, a library of mutants consist of CYP119 variants was created via application of combinatorial active site saturation test (CAST) in amino acid positions 213 – 214 and an effective fluorescence-based method was developed to screen the library for increased peroxidase activity while utilizing hydrogen peroxide as oxidant. After screening of mutant library, a variant with Thr213Arg – Thr214Ile substitutions showed 1.32-fold increased peroxidase activity in the catalysis of Amplex Red compared to wild type CYP119.

Doğal seçilimden ilham alan yönlendirilmiş evrim, protein mühendisliğinde enzimler tasarlanırken sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Laboratuvar ortamında rastgele mutasyon uygulanarak, mevcut proteinlerin istenen karakterleri taşıyan proteinlere yinelemeli olarak evrilmelerine olanak tanımaktadır. Bununla birlikte, kütüphane oluşturulması, yönlendirilmiş evrimin en temel parçalarından biridir. Farklı inşa metodlarının kullanılması hem oluşturulan varyantların sayısını ve çeşitliliğini hem de kullanılan tarama/seçme tekniklerini etkilemektedir. İlk çıkan prosedürlerden olan hata meyilli PZR, mutasyon yapıcı suşlar, kimyasal mutajenler ve DNA karıştırma tüm genin mutasyonunda başarılı olsa da büyük kütüphaneler oluşturmalarından dolayı daha fazla tarama/seçme zahmeti gerektirdi. Diğer taraftan dejenere primerlerin kullanımı ve bölge doyurma mutasyonu gibi yeni yaklaşımlar, polipeptit zincirinde, belirli bölgelerde bulunan amino asitlerin rastgele mutasyonuna olanak tanıyarak tarama/seçme eforunu azalttı. Özellikle, biyokatalizörlerin aktif bölgeleri hedef olarak seçildi ve katalitik verimlilikleri arttırıldı. Sulfolobus Acidocaldarius’dan gelen, bir P450 protein ailesi üyesi olan CYP119, peroksidasyon, monooksidasyon ve oksidoredüksiyon tepkimelerini gerçekleştirebilen termostabil bir enzimdir. Burada, 213. ve 214. amino asit pozisyonlarında, kombinatoryal aktif bölge doygunluk testi uygulanarak CYP119 varyantlarından oluşan bir mutant kütüphanesi yaratılmış ve hidrojen peroksiti oksidan olarak kullanırken arttırılmış peroksidaz aktivitesi için florasan temelli, etkili bir tarama yöntemi geliştirilmiştir. Mutant kütüphanenin taranması sonucu, Thr213Arg – Thr214Ile mutasyonlarını taşıyan varyantın doğal CYP119 ile karşılaştırıldığında 1.32 kat daha fazla peroksidaz aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir.