Beyin Rejenerasyonunda Diferansiyel Olarak Eksprese Edilen Genlerin Taranması, Fonksiyonel Karakterizasyonu ve Yetişkin Zebrabalığı Modelinde Beyin Hasarını Onarma Potansiyellerinin Araştırılması

Abstract

Zebra balıkları, geniş çaplı hasarlardan sonra dahi beyinlerini yeniden oluşturabilme konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Bu özellikleri, onları doku onarımı ve nörogenez mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model organizma haline getirmektedir. Laboratuvarımız tarafından daha önce yayımlanmış bir çalışmada, legumain (lgmn) adlı bir genin, erişkin zebra balıklarının telensefalon bölgesinde beyin hasarına yanıt olarak diferansiyel şekilde eksprese olduğu belirlenmiştir. Bu durum, lgmn geninin hasara yanıt olarak gelişen rejeneratif süreçte potansiyel bir rol üstlenebileceğini düşündürmektedir. Ancak, bu genin nöro-onarımdaki rolü henüz fonksiyonel olarak araştırılmamıştır. Bu çalışmada, lgmn geninin telensefalik rejenerasyon sürecindeki zamansal ve bölgesel ekspresyon modeli incelenmiş ve detaylandırılmıştır. qPCR analizleri, lgmn mRNA düzeylerinin hasar sonrası dramatik biçimde arttığını göstermiştir. Test edilen zaman noktalarında gözlenen bu artış, genin rejenerasyon süreci boyunca sürekli olarak aktif olduğunu göstermektedir. Ayrıca, lgmn mRNA'sının HuC/HuD, Sox10 ve GFAP belirteçleri ile lokalize olması, lgmn'nin hem nörogenez hem de gliogenez süreçlerinde rol oynayabileceğini düşündürmektedir. lgmn geninin fonksiyonunu değerlendirmek amacıyla, CRISPR/Cas9 teknolojisi kullanılarak bir lgmn knockout zebra balığı hattı oluşturulmuştur. Oluşan mutasyonun çerçeve kayması mutasyonuna neden olduğu, High Resolution Melting Analizi (HRMA) ve Sanger dizileme ile doğrulanmıştır. Ek olarak, knockout hattında yapılan qPCR analizleri, lgmn transkript düzeylerinde belirgin bir azalma göstermiş, bu da nonsense aracılı mRNA yıkım mekanizmasını işaret etmektedir. Genel olarak, elde edilen bulgular lgmn geninin zebra balığı beyin rejenerasyonu sürecinde çoklu aşamalarda dinamik olarak eksprese olduğunu ve nörogenez ile gliogenez sırasında rejenerasyonu destekleyici roller üstlenebileceğini ortaya koymaktadır.Zebrafish have a remarkable ability to regenerate their brain even after extensive damage. This makes them an ideal model organism for studying mechanisms of tissue repair and neurogenesis. In a previously published paper from our lab, a gene called legumain (lgmn) was identified as a differentially expressed gene in response to brain injury in adult zebrafish telencephalon. This suggested a potential role in regenerative process in response to injury. Yet, its involvement in neurorepair has not been functionally investigated. In this work, the spatiotemporal expression pattern of lgmn during telencephalic regeneration was studied and characterized. Quantitative PCR (qPCR) analysis showed that lgmn mRNA expression increased dramatically post-injury. This upregulation at the tested time points suggested sustained participation during the regeneration process. lgmn mRNA localization with HuC/HuD, Sox10, and GFAP markers, suggests a role both in neurogenesis and gliogenesis during regeneration. For the examination of lgmn function, through CRISPR/Cas9, lgmn knockout zebrafish strain was established. High Resolution Melting Analysis (HRMA) and Sanger sequencing further confirmed the frameshift mutation causing alterations. In addition, qPCR analysis of knockout line revealed a substantial decrease in lgmn transcript levels, suggesting nonsense-mediated mRNA decay. Overall, the findings indicate that lgmn is dynamically expressed among multiple stages of zebrafish brain regeneration and might play pro-regenerative roles during neurogenesis and gliogenesis.