CRISPR-TSKO Sistemi ile Pamukta Gossipol Biyosentezi için Genom Düzenlemesi

Abstract

Gossypium hirsutum, yaygın adıyla yerli pamuk, sadece lif üretimi için değil, aynı zamanda tohum yağı üretimi için de yetiştirilen çok amaçlı bir bitkidir. Pamuk tohumu yağı, yüksek oranda protein (%23) ve yağ asidi (%21) içerdiği için alternatif bir gıda kaynağı olarak görülmektedir. Bitkinin böceklere ve küçük kemirgenlere karşı kendini savunmak amacıyla ürettiği zehirli bir madde olan gossipol, insan sağlığına zararlıdır ve pamuk tohumlarında da bu moleküle rastlandığı için gossipolden arındırılmamış pamuk yağı gıda olarak kullanılamaz. Gossipolün pamuk yağından uzaklaştırılması ise yağ elde etme sürecine fazladan maliyet ve zaman ekler. Gossipol, pamuk bitkilerince üretilen ve özel bezelerde sentezlenip depolanan bir ikincil metabolittir. Bu çalışmada, gossipol bezelerinin oluşumu ve gossipol biyosentezi için gerekli bir transkripsiyon faktörünü kodlayan CGF3 geni, CRISPR/Cas9 sistemiyle hedef alınmış ve bu bezelerin tüm dokularda oluşmasını engelleyecek mutasyonların oluşturulması amaçlanmıştır. Böylece bezsiz (glandless) pamuk bitkisi elde edilmesi hedeflenmiştir. Ancak bitkinin zararlılara karşı korunabilmesi için tohum dışındaki yeşil dokularda bezelerin tekrar oluşturulması planlanmaktadır. Bunun sağlanabilmesi için sonraki çalışmalarda CGF3 geninin yalnızca yeşil dokularda yeniden aktifleşmesini sağlayacak CRISPR/TSKO sistemi kullanılacaktır. Bu kapsamda, Türkiye'de geliştirilmiş Lodos pamuk çeşidi genetik materyal olarak seçilmiştir. Ancak bu çeşit için optimize edilmiş bir transformasyon yöntemi bulunmadığından, yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Seçilen vektör, CRISPR/Cas9 ifadesi sağlayan pKSE401 plazmididir. Bu plazmide, CGF3 genini hedefleyen gRNA dizilerini içeren bir kaset entegre edilmiştir. Sonuç olarak, gRNA içermeyen pKSE401 ile Lodos için bir transformasyon yöntemi optimize edilmiştir. Ancak gRNA içeren vektörle transformasyon için ek deneyler gereklidir.Upland cotton (Gossypium hirsutum) is a multipurpose crop, cultivated for its fiber and oil content, as cotton seed oil is considered an alternative food source since it contains high amounts of protein (23%) and fatty acids (21%) beneficial for human health. However, the presence of a toxic compound called gossypol, a crucial defense mechanism for the plant against pests and small rodents, causes serious health issues in humans, making untreated cotton oil unfavorable for use as food. The removal of gossypol from cotton seed oil adds steps to the extraction process and costs resources and time. Gossypol is a secondary metabolite synthesized and stored in gossypol glands found throughout the tissues of Gossypium species. In this study, CGF3, a gene that encodes a transcription factor required for both gossypol gland formation and biosynthesis, was targeted by the CRISPR/Cas9 system to induce mutations aiming to inhibit gland formation in all tissues. This would result in a glandless phenotype cotton. To restore gossypol glands in non-seed tissue ensuring protection from pests, the function of CGF3 will be restored via the CRISPR/TSKO system only in green tissues. The Turkish cultivar Lodos was chosen as the genetic material; however, there was no optimized transformation method available. Thus, a shoot apical meristem transformation method was developed prior to vector construction. The destination vector was the pKSE401 CRISPR/Cas9 expression vector, and the desired vector was constructed by integrating a cassette containing gRNAs targeting CGF3. Additional experiments are required for transformation with the vector containing gRNAs.