Development of a Nucleic Acid-Based Isothermal Diagnostic Test for Border Disease Which Causes Losses in Animal Husbandry

Abstract

Border disease is viral infection of ruminants, and it is associated with abortions, stillbirth, and birth of persistently infected (PI) lambs. It has a great potential to cause an outbreak and it is declared as one of the notifiable diseases of ruminants by World Organization for Animal Health (OIE). Border disease poses a threat against ruminant farming industry by causing major economic losses. Since there is no treatment or vaccine against border disease virus (BDV), early diagnosis and early isolation of infected animals is necessary. RT-qPCR is the gold-standard method for BDV identification, but it can only be applied by trained personnel in a laboratory with expensive instruments. There is a need for a point-of-care (POC) test, specifically designed for BDV. This thesis study aimed to develop a nucleic acid-based loop mediated isothermal amplification (LAMP) technique for BDV identification. LAMP is a nucleic acid identification technique that can be performed using 4-6 primers at a constant temperature with a Bst DNA polymerase. Firstly, multiple alignment of BDV sequences across the world was performed and most conserved region of genome was detected as 5’UTR. Then, three LAMP primer sets 1, 2a and 2b were designed to target 5’UTR. Designed primer sets were optimized in terms of temperature, fluorescent dye, primer mix, Mg2+ and enzyme concentration. After designation of optimum conditions, limit of detection (LOD) was determined for each primer set and their performances were compared. All primer sets have LOD equals to 2x104 copies/μl. Overall, primer set 1 and 2b has higher sensitivity and specificity compared to primer set 2a, therefore they are more suitable to be used for BDV identification with LAMP.

Border (sınır) hastalığı, küçükbaş hayvanlarda görülen ve düşükler, ölü doğumlar ve persiste enfekte (PI) kuzuların doğumu ile ilişkilendirilen bir viral enfeksiyondur. Yakın temasla yüksek hızda bulaşan virüs (BDV), küçükbaş hayvancılık endüstrisi için büyük bir ekonomik tehdit oluşturmaktır. Bu nedenle, Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü (OIE) tarafından bildirilmesi zorunlu hastalıklardan biri olarak görülmektedir. BDV'ye karşı bir tedavi veya aşı bulunmadığından, enfekte hayvanların erken teşhisi ve erken izolasyonu, hastalığın yayılmasını önlemenin tek yoludur. Bu sebeple, sahada BDV tanımlaması için kullanılabilecek hızlı ve ekonomik bir tanı testine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu tez çalışması, BDV tespiti için bir nükleik asit bazlı bir izotermal amplifikasyon (LAMP) tekniği geliştirmeyi amaçlamıştır. LAMP, DNA iplikçiklerini ayırma kabiliyeti olan bir Bst DNA polimeraz ile sabit bir sıcaklıkta, 4-6 primer kullanılarak gerçekleştirilebilen bir yöntemdir. Bu tez çalışmasında dünyanın farklı bölgelerinden izole edilmiş BDV genomlarının çoklu sekans dizilimleri gerçekleştirildi ve genomun en çok korunan bölgesinin 5'UTR olduğu tespit edildi. Ardından, 5'UTR'yi hedeflemek için LAMP primer set 1, 2a ve 2b tasarlandı. Tasarlanan primer setleri sıcaklık, floresan boya konsantrasyonu, primer karışım konsantrasyonu, Mg2+ konsantrasyonu ve enzim konsantrasyonu açısından optimize edilmiştir. Optimum koşullar belirlendikten sonra her bir primer seti için gözlemlenebilme sınırı (LOD) belirlendi ve performansları karşılaştırıldı. Tüm primer setlerinin gözlemlenebilme sınırı 2 x104 kopya/μl olarak belirlendi. Primer set 1 ve 2b, primer set 2a'ya kıyasla daha yüksek duyarlılığa ve özgüllüğe sahip olması nedeniyle LAMP ile BDV tanımlaması için kullanılmaya uygun görüldü.