Optik Spektroskopi Teknikler Kullanarak Rna Metilasyonunun Araştırılması

Abstract

N6-metiladenozin (m6A), en yaygın RNA modifikasyonlarından biridir ve RNA'nın işlenmesi, kararlılığı, nükleustan taşınması ve translasyonunun düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Bu tezde, m6A metilasyonun FT-IR, CD sinyali ve ikincil yapıdaki transkripsiyon sonrası modifikasyonlar incelenmektedir. FT-IR spektroskopisi, zayıflatılmış toplam yansıma (ATR) yöntemiyle birleştirilerek, metil grubunun titreşimsel davranışını analiz etmek amacıyla giderek karmaşıklaşan sistemlerde sistematik biçimde kullanılmıştır. Ana CH₃ gerilme ve bükülme modları, ilk olarak metanol gibi basit moleküllerde gözlemlenmiş sonrasında DNA, sentetik RNA ve nihayetinde hücre kaynaklı RNA gibi daha büyük sistemlerde uygulanmıştır. Özellikle, CH₃ bükülme modları yaklaşık 1478 ve 1332 cm⁻¹'de, CH₃ gerilme modları ise yaklaşık 2984 ve 2883 cm⁻¹'de ortaya çıkmıştır. Bu modlar metilasyonun göstergeleri olarak değerlendirilmiştir. Bu tayinler, metillenmiş ve metillenmemiş türler arasında net spektral ayrım yapılmasını mümkün kılarak, hücre kaynaklı RNA'larda m6A tespiti için moleküler bir parmak izi sunmuştur. Dairesel dikroizm (CD) spektroskopisi, RNA'daki lokalize epitranskriptomik yapısal modifikasyonlardan kaynaklanan baz istiflenmesi, baz eşleşmesi ve hairpin oluşumu gibi metilasyona bağlı ikincil yapı değişikliklerini gözlemlemek için kullanılmıştır. Metillenmiş ve metillenmemiş örnekler karşılaştırıldığında, 265 nm'de (baz istiflenmesi) ve 210 nm'de (sarmal asimetri) eliptiklikte önemli değişiklikler gözlemlenmiştir. Bu spektral değişiklikler, lokalize transkripsiyon sonrası konformasyonel değişiklikleri yansıtmaktadır. Bu çalışma ile, spektroskopik (IR) tabanlı RNA m6A metilasyonunun ölçülmesine dayalı alternatif bir yöntemin geliştirilebileceği ve CD spektroskopisi ile, m6A metilasyon kaynaklı transkripsiyon sonrası lokalize yapısal modifikasyonların izlenebileceğini göstermektedir. Bu bulgular ile, spektroskopik analizlerin m6A metilasyonuna dayalı yapısal biyoloji alanında destekleyici nitelikte bilgi ve yöntem sağlanması amaçlanmıştır.

N6-methyladenosine (m6A) is a RNA post-transcriptional modification (PTM) that plays a key role in regulating RNA splicing, stability, export, and translation. In this thesis, the methylation FT-IR, CD signals, and secondary conformational changes caused by m6A are examined. Fourier Transform-Infrared (FT-IR) spectroscopy, combined with the attenuated total reflectance (ATR) unit, was systematically applied to increasingly complex systems to analyze the vibrational behavior of the methyl group. The main CH₃ stretching and bending modes were first observed in simple molecules such as methanol, then generalized to larger systems including DNA, synthetic RNA, and ultimately, cell- derived RNA. Notably, CH₃ bending modes appeared at approximately 1478 and 1332 cm⁻¹, while CH₃ stretching modes were observed at around 2984 and 2883 cm⁻¹, serving as indicators of methylation. These assignments enabled clear spectral differentiation between methylated and unmethylated species and provided a molecular fingerprint for m6A detection in cell-derived RNAs. Circular dichroism (CD) spectroscopy was used to identify methylation-dependent secondary structure changes, such as variations in base stacking, base pairing, and hairpin formation, which may result from localized epitranscriptomic structural modifications in RNA. Significant changes in ellipticity were observed at around 265 nm (base stacking) and around 210 nm (helical asymmetry), and around 235-240 nm for hairpin, when comparing methylated and unmethylated samples. These spectra reflected localized conformational alterations. Overall, this work demonstrates that the IR-based method is a viable technique for m6A detection, and when combined with CD, can be used to monitor RNA m6A methylation and the localized structural modifications resulting from PTMs, thereby supporting m6A studies and PTMs.