Production of teriparatide, a biotechnological drug, with a novel method

Abstract

Osteoporoz, kemik mikro yapısındaki eksiklikler ve azalmış kemik kütle yoğunluğu ile karakterize edilen bir kemik hastalığıdır. Paratiroid hormonunun bir parçası olan teriparatide peptidi, osteoporoz tedavisinde kullanılır. Teriparatid, 2002 yılında FDA tarafından onaylandı ve patenti sona erdikten sonra biyobenzer üretimi için bir hedef haline geldi. Rekombinant olarak peptit üretmenin zor olan tarafı, peptidin düşük moleküler ağırlığı ve üç boyutlu yapısının olmaması nedeniyle konakçının proteazları tarafından kolayca parçalanmasıdır. Literatürde, bu sorunu aşmak için füzyon protein ile etiketleyerek teriparatide üretimi önerilmiştir. Bu projenin amacı, teriparatide peptidini NTL9-TEV proteaz kesim bölgesi ve teriparatide füzyon proteini halinde üretmektir. Üretim E. coli hücrelerinde, peptidin çözünürlüğünü arttırması beklenen NTL9 etiketi, TEV proteaz kesim bölgesi ve teriparatide peptit geni içeren bir plazmit ile gerçekleştirilmiştir. NTL9 ve teriparatid içeren füzyon proteini, üretimden sonra saflaştırmış ve kütle spektrometrisi ile doğrulanmıştır. Son olarak, en verimli üretim sonucuna litrede 35 mg füzyon protein, 1 mM IPTG indüksiyon koşuluna sahip TB ortamında 30 °C elde edilmiştir. Saflaştırmada ilk olarak Ni-NTA afinite kromatografisi; ardından iyon değişim kromatografisi kullanılmıştır. Teriparatide peptidinin %100'ü, füzyon proteinin %98,3'ü LC-MS ile doğrulanmıştır. Füzyon proteininin TEV proteaz ile kesim çalışmaları, 4°C ve 30°C'de 1 saatten 3 güne kadar inkübasyon süreleri de dahil olmak üzere çeşitli koşullar altında test edilmiş, ancak kesim verimli şekilde gerçekleştirilememiştir. Füzyon proteinin TEV proteaz ile kesiminin optimizasyon çalışmalarına devam edilecektir.

Osteoporosis is a bone disease characterized by deficiencies in bone microstructure and decreased bone mass density. Teriparatide is a peptide derived from parathyroid hormone. Teriparatide was approved by the FDA in 2002 for the treatment of osteoporosis and following its patent expiration, companies are racing to produce teriparatide as biosimilar. The challenge of peptide production by recombinant methods is that the host's proteases easily degrade the peptide due to the peptide's small size and lack of defined structure. To overcome this problem, using a fusion tag is suggested for teriparatide production in the literature. This project aims to produce biosimilar teriparatide molecule with a novel construct: NTL9-teriparatide fusion protein. Production was done in E. coli with a plasmid designed: NTL9 (N-terminal domain of ribosomal protein L9, the fusion partner is a solubility-enhancing tag), TEV protease cleavage site, and teriparatide peptide. The fusion protein NTL9-teriparatide was purified after production and was verified with mass spectrometry. The most efficient production condition was 30°C in TB media with 1 mM of IPTG. We got 35 mg/L fusion protein. Regarding purification, Ni-NTA affinity chromatography was used first, followed by ion exchange chromatography. 98.3% of the fusion protein and 100% of teriparatide peptide was confirmed by LC-MS. Teriparatide was cleaved from the fusion protein using TEV protease under various conditions, including incubation times of 1 hour to 3 days at 4°C and 30°C, but cleavage efficiency remained a challenge. Optimization of TEV protease cleavage of the fusion protein will continue in Dr. Taşkent Sezgin's laboratory.