The Morphology and Kinetics Control of Calcium Phosphate Mineralization Using Tiny Enzymes Identified Through Deep-Directed Evolution

Abstract

Biyomineralizasyon çeşitli organizmalarda inorganik iyonların organik protein molekülleri ile birlikte koordineli bir şekilde çökelmesine ve büyümesine rehberlik eden temel biyolojik olgudur. İnsanlar başta olmak üzere omurgalılarda kemik ve diş omurgasızlarda yumuşakçaların kabukları gibi sert dokularının oluşumu biyomineralizasyonun bir parçasıdır. Biyomineralizasyonun etkili yönetimi, vasküler kalsifikasyon gibi istenmeyen oluşumları önlemek ve kemik ve diş remineralizasyonu gibi faydalı süreçleri teşvik etmektir. Biyomineralizasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların ve düzenleyici yolların anlaşılması, tıbbi ve dental araştırmaların, terapötik müdahalelerin ve biyomimetik materyal tasarımının ilerletilmesi için gereklidir. Bu sürecin temeli, belirli özelliklere ve işlevlere sahip mineral malzemelerin oluşumunun morfolojisinin ve kinetiğinin hassas bir şekilde kontrol edilmesini içerir. Bu tez, derin yönlendirmeli evrim yoluyla tanımlanan küçük enzimler kullanarak kalsiyum fosfat mineralizasyonunun morfolojisini ve kinetiğini kontrol etmeyi amaçlamaktadır. Kalsiyum fosfat minerallerinin mineralizasyon kinetiğini ve morfolojisini önemli ölçüde yönlendirerek kontrol eden kısa dizili peptitleri (12 amino asit) fizyolojik bir ortamdan seçmek için bir peptit-faj kütüphanesi kullanılmıştır. Mineralizasyon süreci üzerindeki dinamik etkileri bilinen, pH, sıcaklık ve molarite gibi değişkenlerin mineralizasyon için en uygun koşulları yinelemeli deneylerle ayarlanmıştır. Bu peptitlerin varlığında hidroksiapatit kristallerinin oluşumu yapısal karakterizasyon için kullanılan SEM, XRD ve FTIR analizleri ile kanıtlanmıştır. Kinetik ölçümler, bu peptitlerin fizyolojik koşullar altında kalsiyum fosfat mineralizasyonunu yaklaşık bir kat daha hızlı katalize ettiği kinetik ölçümler ile ortaya koymuştur. Mineral kristalleri üzerinde etkisi doğrulanan bu peptitler diş jelleri, diş macunu formülasyonları ve kemik rejenerasyonu tedavileri gibi klinik ürünlerin geliştirilmesi için potansiyel taşımaktadır.

Biomineralization is a critical natural process through which organisms produce minerals to harden or stiffen tissues, forming structures such as bones, shells, and teeth. Controlling biomineralization is vital for addressing medical and dental disorders, which significantly impact healthcare costs and quality of life. Effective management of biomineralization can prevent undesirable occurrences, such as vascular calcification, and promote beneficial processes, like bone and dental remineralization. While the chemical mechanisms inducing demineralization are well understood, the ability to rebuild a molecularly integrated mineral layer at a useful rate remains elusive. A fundamental aspect of this process involves the precise control of the morphology and kinetics of mineral formation, which can yield materials with specific properties and functions. This thesis aims to control the morphology and kinetics of calcium phosphate mineralization using tiny enzymes identified through deep-directed evolution. A peptide-phage library was utilized to select short-sequence peptides (12 amino acids) from a physiological environment, significantly impacting the mineralization kinetics and morphology of calcium phosphate minerals. Through iterative experimentation, the optimal conditions for variables such as pH, temperature, and molarity were adjusted, acknowledging their dynamic influence on the mineralization process. Structural characterization using SEM, XRD, and FTIR analyses confirmed the formation of hydroxyapatite in the presence of these peptides. Kinetic measurements revealed that these peptides catalyze calcium phosphate mineralization approximately an order of magnitude faster under physiological conditions. These peptides hold the potential for developing clinical products, such as dental gels, toothpaste formulations, and treatments for bone regeneration.